Rijksoverheidslogo
Nationaal Kenniscentrum Alternatieven voor dierproeven

Onderzoek bruikbaarheid van alternatieven voor dierproeven bij beoordelen stoffen

Etje Hulzebos

Etje Hulzenbos, promovendus Universiteit van Amsterdam, ontwikkelde een evaluatieschema waarmee kwaliteit van verschillende soorten testen langs dezelfde meetlat gelegd kan worden. De driekleuren ring geeft de drie modules aan (betrouwbaarheid van resultaat, validiteit van methoede en of het nodig is voor REACH). Hoe meer overlap er is tussen de drie modules, dess te accpetabeler is het resultaat.

Dierproeven om de schadelijkheid van een chemische stof te bepalen zijn in veel gevallen te voorkomen door kennis van de chemische eigenschappen te gebruiken. Dit stelt toxicologe Etje Hulzebos, die in september 2012 promoveerde aan de Universiteit van Amsterdam met haar onderzoek ‘(Q)sar and other (non) testing data in Integrated Testing Stategies using standardised Weight of Evidence’. Het onderzoek richtte zich op de bruikbaarheid van alternatieven voor dierproeven om de toxische effecten van stoffen te beoordelen. Omdat er vaak koudwatervrees voor deze alternatieven bestaat, ontwikkelde Hulzebos een evaluatieschema (Integrated Assessment scheme the IAS) waarmee de kwaliteit van experimentele testen en van computer modellen langs eenzelfde meetlat gelegd kunnen worden. Hierdoor kan toxicologische informatie eenvoudiger geïntegreerd worden, waardoor een nieuw dierproef niet altijd nodig is.

De kracht van haar proefschrift vindt Hulzebos zelf het ontwikkelde beslisschema. “Hierin worden vragen gesteld over de kwaliteit van de uitkomst van het onderzoek naar een teststof. Die vragen zijn hetzelfde voor in vivo, in vitro en in silico onderzoek (Zie figuur 1).

Etje Hulzenbos schema vragen

Figuur 1

Met de vijf vragen in de linker kolom en de 15 antwoorden in de rechter kolommen, kan de adequaatheid van de informatie beoordeeld worden.

Elke test kun je beoordelen door antwoord te geven op dezelfde vragen (eerste kolom). Op die manier leg je verschillende testmethodes langs dezelfde meetlat. Vervolgens kun je kijken waar testen goed scoren en waar minder. Op die manier kun je het beste resultaat kiezen voor het benodigde toxicologische eindpunt. Als er meerdere resultaten zijn die deels de REACH vraag beantwoorden, kunnen die gezamenlijk gebruikt worden. (Zie figuur 2)

Etje Hulzenbos figuur 2

Figuur 2

De eerste bloem is een voorbeeld van een resultaat dat helemaal goed is uitgevoerd en geaccepteerd zal worden door de autoriteiten. De vaas geeft aan dat resultaten die deels de vraag beantwoorden, gecombineerd kunnen worden. De derde bloem geeft aan dat er ook gegevens of resultaten zijn die niet bijdragen om het toxicologisch eindpunt te beoordelen.

Met het beslisschema wil Hulzebos een brug slaan tussen de ontwikkelaars van alternatieve methoden, de Industrie die de stoffen moet registreren en de autoriteiten die op basis van de aangeleverde data moet beoordelen of de registrant voldoende gegevens heeft aangeleverd. “Mensen vinden het een mooi model, maar het wordt nog weinig gebruikt. Het is de uitdaging om het zo op te zetten dat ook regelgevende instanties het kunnen gebruiken.” Hulzebos hoopt dat er daardoor dierproeven voorkomen worden, want dat was haar motivatie voor haar jarenlange onderzoek. “Minder dierproeven door veel beter gebruik te maken van bestaande en alternatieve data.”

Veranderingen

Zo’n vijf jaar geleden was het beoordelen van de testen nog de verantwoordelijkheid van de overheid. Inmiddels ligt die verantwoordelijkheid bij de industrie. In het kader van de Europese richtlijn REACH (Registration, Evaluation, Authorization and Restriction of Chemicals) moeten voor tienduizenden stoffen potentiële risico’s worden vastgesteld. Al snel werd duidelijk dat al die stoffen niet allemaal in vivo getest kunnen worden. Dat is veel te tijdrovend en te kostbaar. Dat vroeg om een andere manier van testen: meer integratie van gegevens die er zijn en gebruik van in vitro en in silico methoden.

Vergelijking bestaande stoffen

“Bij het ontwikkelen van het IASchema vroeg ik me soms wel af of deze kwaliteitsbeoordeling niet een open deur is”, kijkt Hulzenbos terug. De vragen in de eerste kolom zijn volgens Hulzenbos de basisvragen om te beoordelen of een onderzoek goed is opgezet. Die vragen zijn: wat is het onderwerp, hoe is de methode, wanneer werkt de methode, wat is de onzekerheid en waarom werkt het. Het beslisschema laat zien wanneer voldoende gegevens zijn aangeleverd onder REACH. “Eigenlijk is het verzamelen van bestaande data en een vergelijking maken met bekende stoffen, iets dat een ervaren toxicoloog uit een soort routine doet. Hulzebos merkte dat bij het beoordelen van nieuwe stoffen toen ze nog bij het RIVM werkte. “Na een tijdje kom je stoffen tegen met een structuur die je eerder hebt gezien. Dan ging ik kijken of die nieuwe stof wat betreft reproductietoxiciteit te vergelijken was met de stof die ik eerder had beoordeeld. Zo krijg je op een gegeven moment nog zonder dat je getest hebt, een eerste gevoel voor het effect van bepaalde stoffen.”

Ontbrekend handvat

De officiële richtlijn is al dat alle bestaande data gecombineerd moeten worden voordat een dierproef ingezet mag worden. Hulzenbos: “Maar dat is gemakkelijker gezegd dan gedaan. Gaandeweg ontdekte ik dat het beslisschema dat ik ontwikkelde juist het ontbrekende handvat was om dat daadwerkelijk te kunnen doen.” Het European Chemicals Agency (ECHA) kan inmiddels zien hoe vaak de industrie alternatieve methodes heeft gebruikt bij het vullen van dossiers. Volgens Hulzebos kan haar beslisschema door de industrie gebruikt worden om te onderbouwen waarom een zusterstof lijkt op de geregistreerde stof. Als dat aangetoond kan worden zijn aanvullende testen niet nodig. Ook kan het gebruik worden voor (kwantitatieve) structuur-activiteitsrelaties

Qsar

Illustratie interview Ertje Hulzebos

Quantitatieve structure-activity relationship (Qsar) is een door statistische analyse gevonden kwantitatief of kwalitatief verband tussen de molecuulstructuur en de biologische activiteit van een stof. Qsars worden van oudsher veel gebruikt in de farmaceutische industrie en is een goede techniek om een eerste selectie te maken uit een zeer grote verzameling kandidaat moleculen. Door Qsars hoeven niet alle individuele moleculen daadwerkelijk in het lab onderzocht te worden. Sinds de jaren 70 van de vorige eeuw zijn ook (q)sars ontwikkeld om de toxiciteit van stoffen te voorspellen. Hulzebos ontwikkelde samen met Ingrid Gerner een Qsar om huidirritatie te voorspellen. Deze methode is ook gebruikt om het beslisschema in figuur 1 te illustreren.

Aanpak in Amerika

Hulzebos richtte zich in haar onderzoek op het verband tussen de molecuulstructuur van de stof en de activiteit van een stof. Op die manier kunnen overeenkomsten gevonden worden die het testen van elke stof apart overbodig maken. In Amerika hadden ze hier al twintig jaar ervaring mee en eind jaren 90 van de vorige eeuw mocht Hulzebos een week in hun keuken mee kijken. In Amerika bepaalt de overheid bij de registratie van een stof aan de hand van de structuurformule of een stof als toxisch wordt aangemerkt. Als de industrie het met die beslissing niet eens is, kan ze data aanleveren om dat te weerleggen. Deze methodiek van de Amerikaanse overheid is pragmatisch, maar dat wordt niet als probleem gezien. Het is een manier om een eerste oordeel te vellen en de industrie vervolgens te vragen om met data te komen. Daarbij wordt ook gekeken naar de blootstelling voor werknemer en milieu en inhalatie en huidabsorptie. Als die klein zijn worden minder strenge eisen gesteld aan de benodigde gegevens. In Europa moest de industrie in het pre-REACH een standaard set aan data aanleveren bij de regelgevende overheden om aan te tonen dat een stof niet ernstig toxisch is en pas daarna spreekt de overheid een oordeel uit over de hoe de stof veilig te gebruiken. Bij de vergelijking van de Amerikaanse en Europese methode keek Hulzebos ook naar de voorspellende waarde. “Die was wisselend. Het bleek dat de Amerikaanse methode wel goed kon voorspellen wat een stof doet, maar niet wat de stof niet doet.” Hulzebos is jaren bezig geweest om een methode te ontwikkelen die betrouwbaarder is wat betreft voorspellende waarde. Ze bouwde daarbij voort op het qsar model van Ingrid Gerner voor testen van stoffen op huidirritatie.

Lees meer: Academisch proefschrift Etje Hulzenbos '(Q)SAR and other (non) testing data in Integrated Testing Strategies using Standardized Weight of Evidence Criteria'.

.