Rijksoverheidslogo
Nationaal Kenniscentrum Alternatieven voor dierproeven

Stamcelonderzoek brengt aantal proefdieren terug

Peter Theunissen

Peter Theunissen, RIVM en Hogeschool Utrecht

Voor onderzoek naar toxiciteit van stoffen worden nog steeds veel proefdieren gebruikt. Alleen al in het kader van REACH, de Europese verordening voor de registratie, evaluatie en toelating van chemische stoffen die in de Europese Unie geproduceerd of geïmporteerd worden, zijn tot 2018 negen miljoen proefdieren nodig. Ongeveer 60 procent van deze dieren wordt gebruikt voor ontwikkelings- en voortplantingsstudies. Embryonale stamcellen vormen een proefdiervrij in vitro-model dat ontwikkeling tot elk celtype van het embryo mogelijk maakt. Peter Theunissen, onderzoeker bij het RIVM en de Hogeschool Utrecht, doet al jaren onderzoek naar de mogelijkheden om stamcellen te gebruiken voor onderzoek naar ontwikkelingstoxicologie. “Dit soort in vitro testen maken dierproeven niet overbodig, maar ze kunnen het aantal dierproeven wel sterk terugbrengen.”

Stamceltest

Rond 2000 werd de embryonale stamceltest (EST) ontwikkeld en gevalideerd, waarmee in vitro de toxische effecten van stoffen voor de vroege ontwikkeling van het embryo bepaald kunnen worden. In de EST worden embryonale stamcellen van de muis gedifferentieerd tot hartspiercellen (cardiomyocyten) welke in kweek spontaan gaan kloppen. Het effect van een stof op de differentiatie is vervolgens een maat voor de schadelijkheid van de stof. Met deze test wordt een voorspelling gedaan van mogelijke effecten van stoffen op het ongeboren kind. Stoffen kunnen bijvoorbeeld niet schadelijk zijn voor de moeder, maar wel voor het ongeboren kind. Denk daarbij aan het medicijn Thalidomide (Softenon) dat eind jaren vijftig van de vorige eeuw de oorzaak was van de wereldwijde geboorte van meer dan 10.000 baby’s met ernstige geboorte afwijkingen. Hun moeders hadden het medicijn tijdens de zwangerschap voorgeschreven gekregen tegen ochtendmisselijkheid.

Verbeteringen

De eerste validatie van de stamceltest liet een voorspellende waarde zien van 78%. Echter, bij gebruik van de EST door de industrie bleek die predictie voor sommige stof groepen maar 15 procent. “Het testsysteem moest dus verbeterd worden en de toepasbaarheid van het systeem moest worden bepaald”, vertelt Theunissen. Eén van de dingen die anders moest was het vinden van betere eindpunten. “Het met het oog vaststellen van het al dan niet kloppen van hartspiercellen is subjectief. Soms kloppen cellen bijvoorbeeld maar heel subtiel. Dat ziet niet iedereen. Eigenlijk zou je de menselijke factor bij dit soort waarnemingen willen uitschakelen.” Daarnaast is alleen kijken naar de effecten van stoffen op hartspierontwikkeling volgens Theunissen te beperkt. “Dat geeft geen uitsluitsel over de effecten van stoffen op bijvoorbeeld de ontwikkeling van botten of de neurale ontwikkeling” Daarom heeft Theunissen de afgelopen vier jaar onderzoek gedaan naar het kweken van neurale cellen uit stamcellen. Vervolgens heeft hij hiermee een nieuw testsysteem ontwikkeld voor het vaststellen van schadelijkheid van stoffen. Theunissen hoopt hierop eind 2012 te promoveren aan de universiteit Maastricht. Hoewel in het verleden werd gedacht dat het mogelijk moest zijn om één in vitro testsysteem te ontwikkelen om alle stoffen te testen op ontwikkelingstoxiciteit, is inmiddels duidelijk dat hiervoor meerdere aparte testsystemen nodig zijn. “Die systemen zijn er nu nog niet”, legt Theunissen uit. Maar onderzoek zoals dat van hem draagt er wel aan bij dat die systemen er komen.

Differentiation track

Om een objectief eindpunt te ontwikkelen voor de hartspier en neurale stamceltesten is gebruik gemaakt van de relatief nieuwe techniek genomics. Met deze techniek kan activiteit van het gehele genoom van cellen bestudeerd worden door het meten van RNA concentraties. RNA is een molecuul dat net als DNA bestaat uit een reeks aan elkaar gekoppelde nucleotiden. In de cellen vind je verschillende typen RNA, die hebben een rol in de productie van eiwitten op basis van informatie uit het DNA. Het RNA laat activiteit in een cel zien, deze is bijvoorbeeld verschillend in een hartspier- of een hersencel die uit stamcellen is gekweekt. De verschillende cellen laten een verschillend RNA-patroon zien. Als je een stof toevoegt aan de cellen, treedt er een verandering op in het RNA patroon. Bij het kweken van neurale cellen uit stamcellen bekijkt Theunissen wat er gebeurt over de tijd. Er zijn duidelijke verschillen van de RNA activiteit te zien in de verschillende fases van de ontwikkeling. Soms vindt die plaats helemaal in het begin van de ontwikkeling en in andere gevallen helemaal aan het eind. Op die manier kun je een spoor vaststellen waarlangs de ontwikkeling normaal verloopt, de zogenaamde 'differentiation track'. Door vervolgens stoffen toe te voegen en het RNA profiel te vergelijken met de controlegroep, wordt duidelijk of de stof een effect heeft op de ontwikkeling. Als die af gaat wijken van de 'differentiation track', weet je op welk punt in de ontwikkeling het effect optreedt. De effecten in een stamceltest zeggen iets over de schadelijkheid van een stof. Wanneer stoffen in de stamceltest schadelijk zijn voor de ontwikkeling van de cellen, kan dit invloed hebben op het al dan niet uitvoeren van een dierproef met de stof. Zo kunnen proefdierstudies verminderd worden en alleen dan toegepast worden als er een goede aanleiding toe is.

Menselijke stamcellen

Op dit moment wordt nog voornamelijk gewerkt met muizenstamcellen. Die kunnen ten opzichte van stamcellen van de mens relatief gemakkelijk gekweekt worden. Er wordt nu onder andere bij het RIVM onderzocht hoe menselijke stamcellen ingezet kunnen worden voor screening binnen de ontwikkelingstoxicologie. “Omdat muizen nu eenmaal anders in elkaar zitten dan mensen en dus ook lang niet altijd hetzelfde reageren op stoffen, zal de voorspelbaarheid met het testen met menselijke stamcellen groter kunnen worden”, verwacht Theunissen.

Database onderzoek

Illustratie interview Peter Theunissen

Theunissen is ook bezig met een ander onderzoek dat tot doel heeft om het aantal dierproeven te verminderen. Voor het testen van stoffen en medicijnen zijn op dit moment proeven in twee diersoorten verplicht, omdat niet elk organisme hetzelfde op een stof reageert. Door een uitgebreid database onderzoek wordt uitgezocht of dat testen op twee diersoorten wel nodig is. “Alle medicijnen die afgelopen jaren op de markt zijn gekomen en een grote groep van medicijnen die niet doorontwikkeld zijn en waarvoor ontwikkelingstoxiciteitstesten in de rat en konijn zijn gedaan, worden in een database ingevoerd. Daarbij wordt gekeken of er significante verschillen zijn tussen de voorspelbaarheid van een test bij ratten of konijnen. En zo ja, voor welke medicijnen gelden deze verschillen. Op deze manier kun je voor toekomstige medicijnen uitzoeken welke diersoort het meest relevant is voor het testen van het medicijn. Ideaal gezien kom je dan uit op het testen op één diersoort, eventueel aangevuld met in vitro testen, zoals bijvoorbeeld testsystemen gebaseerd op stamcel differentiatie. Dat kan heel veel diertesten schelen.”

.