Rijksoverheidslogo
Nationaal Kenniscentrum Alternatieven voor dierproeven

Pre-validatie voor duidelijkheid toepasbaarheid nieuwe 3V-testmethoden

Marc Teunis

Marc Teunis, Hogeschool Utrecht

3V-alternatieven is geen op zichzelf staand vakgebied, maar onderdeel van vakgebieden waar dierproeven worden ingezet in het onderzoek. Daar kwam de Hogeschool Utrecht (HU) achter toen ze enkele jaren geleden een afstudeerrichting 3V-alternatieven wilden opzetten. De afstudeerrichting kwam om deze reden dan ook niet van de grond vertelt Marc Teunis, senior scientist, verbonden aan het lectoraat Innovative Testing in Life Science & Chemistry van de HU. Dit betekent zeker niet dat er op de HU weinig aandacht is voor 3V-alternatieven. In het onderwijs en vooral in het onderzoek van het lectoraat neemt het onderwerp een prominente plaats in.

Aan het hoofd van de onderzoeksgroep staan twee lectoren, Cyrille Krul en Raymond Pieters. Er werken nog veertien andere mensen mee aan het onderzoek. De focus van het lectoraat ligt op de ontwikkeling en toepassing van methoden die ingezet worden in toxicologie en werkzaamheidstudies. De HU is in samenwerking met andere partijen ook betrokken bij pre-validatie van in vitro testen voor het vaststellen van toxiciteit van stoffen. De pre-validatie studies zijn voor het lectoraat belangrijke activiteiten omdat ze bijdragen aan meer kennis over bepaalde veelbelovende methoden. Ook zijn de resultaten vrijwel direct toepasbaar zijn in de praktijk. Het lectoraat beschikt over studenten die de robuustheid van de methode kunnen onderzoeken en uittesten. Op deze manier levert het lectoraat een directe bijdrage aan de implementatie en acceptatie van in vitro methoden.

Voorsorteren

Illustratie interview Marc Teunis

“Pre-validatie is bedoeld voor een methode die nog niet kant-en-klaar is en nog niet geschikt is voor formele validatie”, legt Teunis uit. “Ik zie het als een soort voorsorteren. Er zijn verschillende hobbels onderweg en aan het eind weet je of de methode geschikt is om door te gaan naar de validatie fase”. Als de methode geschikt is, geeft het pre-validatie traject je als het goed is verschillende inzichten om de formele validatie goed uit te kunnen voeren. Het ontwikkelen van een 3V-methode is volgens Teunis een langdurig proces. Van de eerste ontwikkeling tot en met de formele validatie kan al snel tien jaar duren. Het proces kost volgens Teunis met name zo veel tijd omdat de methode in verschillende labs uitgetest moet worden. Alleen zo ontstaat er een goed beeld of een methode ook echt werkt en niet alleen in het lab waar het ontwikkeld is. “Het proces zou sneller kunnen gaan als we meer zouden weten over mechanismen van stoffen en effecten daarvan op organismen. We weten al heel veel, maar nog lang niet alles. Bijvoorbeeld op het gebied van de ontwikkelingsbiologie is er nog veel onbekend”, vertelt Teunis. Om daar meer over te weten te komen is fundamenteel onderzoek hard nodig. Daar worden antwoorden gevonden. Dat onderzoek kan dan in veel gevallen vertaald worden naar toepassingen, zoals nieuwe toxicologische testsystemen. Teunis: “De rol van ons lectoraat is om een brug te slaan tussen de fundamentele kennis en de toepassing er van. Op die manier kunnen we bijvoorbeeld een antwoord geven welke methode gebruikt kan worden om een stof op de markt te brengen of te classificeren.”

Europees project

Als voorbeeld van een pre-validatie project vertelt Teunis hoe het lectoraat in 2007 betrokken raakte bij een groot Europees project om 3V-alternatieven voor het testen van stoffen op huid- en ademhalingsensibilisatie te ontwikkelen. Voor dat project werd de HU gevraagd een Summercourse te organiseren om kennis over te dragen. Aan de cursus die in 2010 werd gegeven, namen AIO’s, analisten en vertegenwoordigers van regelgevende instanties uit zeven Europese landen deel. Voor twee testmethoden die veelbelovend leken, werd met financiële ondersteuning van ZonMw een pre-validatiestudie opgezet. De HU is daarbij penvoerder en Teunis de projectleider.

Protocol

Voor de pre-validatiestudie was twee jaar uitgetrokken. Teunis: “Het eerste half jaar hebben we ons vooral bezig gehouden met het protocol.” In het lab waar de methode is ontwikkeld was wel een protocol opgesteld, maar dat riep bij andere labs vragen op. In eerste instantie zijn de methoden in drie labs uitgetest. Vervolgens is met zes labs een zogenaamde ringstudie uitgevoerd om te kijken of de methode over te dragen is en hoe voorspellend de methode blijkt te zijn als er geblindeerde stoffen worden getest.” De ringstudie moet er voor zorgen dat het protocol zo geharmoniseerd wordt, dat overal precies dezelfde aanpak gevolgd wordt. Ook moeten medewerkers getraind worden en moet gekeken worden of de methode reproduceerbaar is.

Methode en Resultaten

De methode die tijdens de ringstudie is onderzocht bestaat uit een tweetal assays. Een dergelijke methode wordt ook wel een tiered-approach genoemd, waarbij je in een vaste volgorde een test uitvoert. Elke assay in de test geeft een bepaalde uitslag. De gezamenlijke resultaten van de methode geeft in dit geval een indicatie over of een stof huid-sensibiliserende eigenschappen heeft, en hoe sterk die eigenschap is. In de eerste assay van de methode wordt gebruik gemaakt van menselijke huidcellen (keratinocyten). Wanneer deze worden blootgesteld aan een huid-sensibiliserende stof (sensitizer) dan reageren deze cellen daarop met de productie van signaalmoleculen. In vivo zijn deze moleculen verantwoordelijk voor de activatie van het immuunsysteem waardoor er een allergische reactie tot stand zou kunnen komen. “In deze assay gebruiken we de productiehoeveelheid van deze signaalmoleculen als maat voor het al dan niet sensibiliserend zijn van een stof. Indien de productie van bepaalde signaalmoleculen, door de cellen na blootstelling aan een stof, boven een bepaalde drempelwaarde aanwezig zijn noemen we deze stof een sensitizer.” De tweede assay is een huidmodel dat wordt gemaakt met menselijke huidcellen. Blootstelling van dit huidmodel aan huid-sensibiliserende stoffen kan leiden tot celdood in het model en ook tot productie van signaalmoleculen. De hoeveelheid celdood en de hoeveelheid productie van signaalmoleculen gecombineerd, geeft de sterkte van de stof weer. “We noemen deze assay daarom ook wel de potency assay,”vertelt Teunis.

Voorspellende waarde

Nadat medewerkers in de laboratoria het werken met de methoden onder de knie hadden zijn in de eerste assay 24 sensitizers and non-sensitizers en in de tweede assay dertien sensitizers getest. De onderzoekers weten dan niet welke stoffen er getest worden, omdat de stoffen gecodeerd aangeleverd worden. “Door de resultaten van de testen uit de verschillende laboratoria te analyseren, kom je meer te weten over de voorspellende waarde en de betrouwbaarheid van de test. De resultaten van de ring-studie zijn nu aangeboden aan ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) voor formele validatie,“ vertelt Teunis. Ondertussen gaat de onderzoeksgroep verder om een aantal van de experimenten te herhalen. De methode kan op dit moment al gebruikt worden in een ‘niet-regulatoire’ setting, dus bijvoorbeeld voor research & development van chemicaliën. Door de pre-validatie is nu in kaart gebracht wat de sterke kanten van de methode zijn en waar nog nader onderzoek nodig is.

.